1概述

熒光定量PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸技術(shù)，它是核酸探針技術(shù)、熒光共振能量傳遞技術(shù)和PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，而探針是整個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)的核心。其主要功能是對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，確定病毒含量。實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)的PCR相比，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前已在基因工程，分子生物學(xué)研究，畜牧獸醫(yī)等領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用

2熒光定量PCR技術(shù)的原理

熒光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)，利用熒光定量PCR儀自動(dòng)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的積累，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。由于PCR并非一直呈指數(shù)擴(kuò)增，使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒(méi)有一個(gè)固定的比例關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物很難對(duì)原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，因此熒光定量PCR引入一個(gè)概念，即循環(huán)閾值(cycle threshold value，Ct)。其含義是在PCR循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。經(jīng)數(shù)學(xué)理論證明，Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。

2.1熒光定量PCR技術(shù)的兩種定量形式

熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品選擇很重要，盡量選擇與實(shí)際檢測(cè)樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品，通常采用重組質(zhì)粒或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。一般情況下，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品較常見(jiàn)，通常將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，然后抽提出質(zhì)粒，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)量濃度，計(jì)算出拷貝數(shù)，并進(jìn)行梯度稀釋。絕對(duì)定量也具有相應(yīng)的不足，標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性很難得到保證，標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)時(shí)間保存可能會(huì)降解，致使?jié)舛认陆�，單位體積的拷貝數(shù)不準(zhǔn)確，影響定量PCR的結(jié)果，導(dǎo)致絕對(duì)定量失去意義。

相對(duì)定量是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較、反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素，通常選用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA。相對(duì)定量包括三種方法：（1）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，目的基因、管家基因分別作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出初始模板量，經(jīng)管家基因均一化處理后，求出目的基因的相對(duì)含量。（2）2-△△Ct法，當(dāng)目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率相等，這時(shí)就不需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線，而是通過(guò)比較△Ct值來(lái)確定目的基因的表達(dá)量。（3）動(dòng)力學(xué)法，在PCR反應(yīng)中，即使相同的基因，擴(kuò)增效率也不可能為1，此方法就很好地反映了每次循環(huán)的擴(kuò)增效率，更接近于實(shí)際反應(yīng)，但由于動(dòng)力學(xué)法涉及到許多數(shù)學(xué)公式，計(jì)算較復(fù)雜，未能得到廣泛的運(yùn)用。

在應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)中，無(wú)論是絕對(duì)定量還是相對(duì)定量仍存在問(wèn)題有侍解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個(gè)必不可少的過(guò)程。目前沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性。另外，由于定量PCR在儀器中自動(dòng)生成結(jié)果，沒(méi)有電泳檢測(cè)的過(guò)程，因此無(wú)法判斷擴(kuò)增片段的大小。此外，熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)成本比較高，從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。

2.2 熒光定量PCR技術(shù)的種類

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的常用的方法包括熒光染料法和探針?lè)ā?

非特異性DNA結(jié)合染料法是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加入了染料分子，反應(yīng)進(jìn)行時(shí)染料與DNA雙鏈結(jié)合，結(jié)合后在激發(fā)光源的照射下發(fā)出熒光信號(hào)，沒(méi)結(jié)合不會(huì)被激發(fā)出任何熒光信號(hào)，其信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。隨著PCR產(chǎn)物的增加，結(jié)合量也增加，同時(shí)熒光信號(hào)也在增大。染料分子除了與特異性的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴(kuò)增過(guò)程中形成的引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而造成擴(kuò)增效率的降低、特異性差。所以該方法對(duì)引物設(shè)計(jì)和試驗(yàn)環(huán)境要去很高。為了分辨非特異性結(jié)合，運(yùn)用溶解曲線的分析數(shù)據(jù)是很好的方法。目前應(yīng)用最廣泛的染料是SYBR Green I。

探針?lè)ㄖ饕�是利用了具�?′~3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，并加入了具有序列特異性的熒光探針。該方法主要特點(diǎn)是模板不但與引物結(jié)合，還要與序列特異性的熒光探針結(jié)合，從而提高了檢測(cè)的特異性。與染料法相比不用繪制溶解曲線，特性性強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果更為可靠。目前市場(chǎng)上的探針主要種類有：TaqMan、Molecular Beacon、hybridization probe等，其中以TaqMan探針應(yīng)用最廣泛，但探針標(biāo)記成本較高，不便普及應(yīng)用

3熒光定量PCR技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

隨著熒光定量PCR技術(shù)的成熟和發(fā)展，對(duì)許多難培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的動(dòng)物傳染病病原用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行診斷就簡(jiǎn)單易行。該技術(shù)還進(jìn)一步的彌補(bǔ)了一般技術(shù)對(duì)疾病亞臨床或潛伏感染的診斷無(wú)能為力的缺點(diǎn)，并且解決了許多烈性傳染病對(duì)人和動(dòng)物造成危害的問(wèn)題，使疾病病原檢測(cè)變的更加安全。目前國(guó)內(nèi)外已建立了許多用于病原體檢測(cè)的熒光定量PCR方法。Takele等建立了定量檢測(cè)來(lái)源于豬的PERV的TaqMan技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)在國(guó)內(nèi)應(yīng)用的比較廣泛，許多家公司已研發(fā)出用于定量檢測(cè)的試劑盒，并推向了市場(chǎng)。Bumstead等（1997）用熒光定量PCR檢測(cè)到雞馬立克氏病病毒存在，而且可準(zhǔn)確定量。陳玉棟等（2003）首次建立了用于檢測(cè)豬瘟兔化弱毒苗的熒光定量PCR方法，解決了豬瘟疫苗株和野毒株很難區(qū)分的難題。宋志軍等（2006）建立了豬PRRSV TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，具有很高的敏敏性，并在2009年王秋泉根據(jù)目前流行的高致病性PRRSV Nsp2基因片段的特征變化設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和探針，建立了檢測(cè)PRRSV變異株的熒光定量PCR方法。另外，熒光定量PCR技術(shù)還應(yīng)用其他重要?jiǎng)游飩魅静〉脑\斷，例如，雞新城疫、禽流感、鴨乙型肝炎、偽狂犬病和口蹄疫等�？傊�，該技術(shù)為獸醫(yī)領(lǐng)域的病原診斷研究提供了重要的方法。

此外，熒光定量PCR技術(shù)在其他方面也得到了廣泛的應(yīng)用，如寄生蟲(chóng)的檢測(cè)和鑒別、細(xì)胞因子表達(dá)定量檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、動(dòng)物檢疫和轉(zhuǎn)基因的研究等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以及試驗(yàn)人員在實(shí)踐中經(jīng)驗(yàn)的積累，會(huì)使熒光定量PCR技術(shù)得到進(jìn)一步完善。http://www.swzp.com/zdcp2.html